|
Biologia ściany naczyniowej - współczesne metody badawcze
Obserwowana na całym świecie epidemia chorób układu krążenia jest jedną z przyczyn szczególnego zainteresowania badaczy biologią ściany naczyniowej. Miażdżyca naczyń tętniczych, główny sprawca tej epidemii, to proces chorobowy doprowadzający do zwężenia światła naczynia i zaburzeń przepływu krwi, aż do jego całkowitego zamknięcia w wyniku tworzenia skrzeplin przyściennych. Opracowanie nowych metod badawczych pozwoliło zweryfikować wiele hipotez rozwoju miażdżycy naczyń i odkryć niektóre z mechanizmów leżących u jej podstaw. Dokonujący się na naszych oczach olbrzymi postęp metod badawczych jest możliwy jedynie dzięki współpracy naukowców reprezentujących prawie wszystkie dziedziny nauki.
Współczesne laboratoria dysponują szerokim materiałem badawczym. Dzięki współpracy z lekarzami wielu specjalności (kardiochirurgami, chirurgami naczyniowymi i kardiologami inwazyjnymi) istnieje możliwość badania tkanek ludzkich od ściśle scharakteryzowanych klinicznie dawców. Fragmenty naczyń krwionośnych pobierane w trakcie operacji, czy blaszki miażdżycowe usuwane za pomocą specjalnych cewników są wykorzystywane do badań morfologicznych i czynnościowych. Stanowią one także źródło komórek dla hodowli tkankowych wykorzystywanych następnie do tworzenia prostych i czytelnych układów doświadczalnych. Innym bardzo ważnym źródłem materiału badawczego są zwierzęta doświadczalne. Opracowanie przez genetyków i biologów molekularnych metod pozwalających na modyfikacje genetyczne u zwierząt pozwoliło, w połączeniu z nowoczesną techniką medyczną, stworzyć nowe potężne narzędzie badawcze. Do tej pory dzięki ww. metodzie zbadano kilkadziesiąt genów mogących teoretycznie uczestniczyć w rozwoju miażdżycy naczyń oraz stworzono zwierzęce fenokopie miażdżycy, które stały się standardowymi modelami do jej badania. Stale zwiększa się liczba firm biotechnologicznych zaopatrujących laboratoria nie tylko w sprzęt i odczynniki, ale także w dowolnego rodzaju tkanki i zwierzęta doświadczalne. Rosnąca konkurencja sprzyja jednocześnie obniżaniu cen, co znacząco zmniejsza koszty badań.
Nie sposób omówić wszystkie metody stosowane współcześnie w badaniu miażdżycy. Na szczególną uwagę zasługują metody badające role monocytów w patogenezie miażdżycy. Jednym z początkowych etapów powstawania blaszki miażdżycowej jest bowiem adhezja monocytów do śródbłonka naczyń. Zakotwiczone monocyty wnikają do ściany naczynia, tam jako makrofagi fagocytują odłożone w jej wnętrzu zmodyfikowane lipidy i przekształcają się w komórki piankowate. Czynniki wzrostu i cytokiny uwalniane z makrofagów powodują migracje mięśni gładkich z warstwy środkowej naczynia i zmianę ich fenotypu na wydzielniczy, co prowadzi do nadprodukcji macierzy pozakomórkowej i zwężenia światła naczynia. Kluczowa rola makrofagów w rozwoju miażdżycy wymusza tworzenie czułych metod ich identyfikacji w ścianie naczyniowej. Powszechnie stosowane jest wybarwianie makrofagów w badanych wycinkach za pomocą monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciwko występującym konstytutywnie na ich powierzchni antygenom. Jednocześnie barwienie na inny kolor jądra komórkowego znacząco zwiększa specyficzność i czułość metody. Po cyfrowej obróbce obrazu program komputerowy identyfikuje makrofagi w miejscu nakładania się dwóch kolorów. Inna technika [1] opracowana w naszym laboratorium pozwala na badanie adhezji makrofagów in vivo. Makrofagi wypłukane z otrzewnej myszy (po wstrzyknięcia środka drażniącego) są inkubowane z fluoryzującymi mikrosferami lateksowymi. Aktywowane, poprzez fagocytozę mikrosfer, makrofagi przylegają do ścianek naczynia pozwalając na ich izolacje. Tak znakowane makrofagi są następnie wstrzykiwane do krwioobiegu badanego zwierzęcia. Seryjne wycinki opuszki aorty po standardowym barwieniu hematoksyliną są oceniane pod mikroskopem fluorescencyjnym, gdzie wyraźnie widoczne są przylegające do śródbłonka aorty makrofagi. Ta prosta metoda pozwala na ocenę in vivo wpływu różnych interwencji farmakologicznych na jeden z najwcześniejszych etapów miażdżycy.
Poza standardowymi badaniami morfologicznymi, jak immunohistochemia i mikroskopia elektronowa, dzięki postępowi biologii molekularnej coraz więcej badaczy próbuje oceniać także zmiany genetyczne oraz zamiany ekspresji genów w badanych tkankach. Stosowane do tej pory techniki laboratoryjne pozwalały jedynie na ocenę ekspresji pojedynczych genów, czy to na poziomie mRNA (Northern blotting, hybrydyzacja in situ, PCR), czy też ich białkowych produktów (Western blotting, immunohistochemia). Podobnie sytuacja przedstawiała się w przypadku oceny zaburzeń genetycznych (ocena kariotypu, hybrydyzacja genomowa, czy bezpośrednie sekwencjonowanie). Wszystkie powyższe metody wymagają posiadania specjalistycznego sprzętu i wysoko wykwalifikowanego personelu, są ponadto pracochłonne i w efekcie drogie. Przed kilku laty pojawiła się nowa technika, która pozwala na ocenę zmian genetycznych i ekspresji genów w szybki i prosty sposób. Co więcej, możliwa jest dzięki niej ocena nie kilku, ale setek i tysięcy genów jednocześnie, czyniąc tą metodę znacznie tańszą od stosowanych do tej pory technik. Opracowana w połowie lat 90-tych przez Browna i Schena [2] technika "microarray" jest ciągle rozwijana i udoskonalana. Jednak zasada jej działania jest ciągle ta sama. Na nośniku, którym może być szklana, silikonowa płytka (chip) lub nylonowa membrana, robot umieszcza w mikronowych odstępach nanogramowe ilości DNA zawierającego unikalne dla poszczególnych genów sekwencje. Podczas inkubacji nośnika z badanym DNA dochodzi do hybrydyzacji komplementarnych łańcuchów. Jeśli badane DNA zostanie oznakowane barwnikiem fluorescencyjnym lub izotopem radioaktywnym możliwa jest ocena jakościowa i ilościowa przeprowadzonej hybrydyzacji. Metoda "microarray" z powodzeniem jest wykorzystywana do oceny ekspresji genów w płytce miażdżycowej [3]. Wyizolowany ze zdrowej i zmienionej miażdżycowo ściany naczyniowej mRNA jest przepisywany w reakcji odwrotnej transkrypcji na cDNA, który jest następnie znakowany rożnymi (dla zdrowej i chorej tkanki) barwnikami fluorescencyjnymi. Po jednoczesnej hybrydyzacji obu badanych próbek na płytce, czytnik laserowy skanuje ją oceniając fluorescencję oddzielnie dla każdego z zastosowanych barwników (zwykle czerwonego i zielonego). Dla każdego genu jest następnie wyliczany stosunek natężenia fluorescencji obu barwników. Tak uzyskane dane liczbowe są następnie opracowywane przy pomocy specjalistycznych programów statystycznych (www.rana.stanford.edu/software), pozwalających na ocenę ogromnej ilości zmiennych znacznie przekraczającej liczbę przypadków. Powyższa technika nie jest oczywiście pozbawiona wad. Poza trudnościami w obróbce danych, metoda nie została do tej pory wystandaryzowana, stąd wyniki uzyskiwane za pomocą różnych technik "microarray" nie mogą być ze sobą porównywane. Oczywistym mankamentem jest ocena ekspresji genów na podstawie obecności w tkance mRNA, co przy obecności bloków ekspresji na poziomie translacji może znacząco zmniejszać specyficzność metody. Obecnie dostępnych jest na rynku wiele rożnych systemów "microarray". Godne polecenia wydają się systemy produkowane przez światowych liderów tego rynku: amerykańskie firmy NEN Life Science, Clontech, Affimetrix, Genomic Solutions i niemiecka MWG Biotech. Dwie ostatnie firmy produkują systemy "microarray" na zamówienie - z zestawem genów wybieranym przez klienta, co znacznie rozszerza możliwości metody.
Technika "microarray", która jeszcze kilka lat temu wydawała się fantazją, staje się powoli standardem w badaniach medycznych. Krokiem w przyszłość jest stworzenie systemów zdolnych do oceny całego ludzkiego genomu, co rozwiąże dylemat badaczy jakie geny zbadać, a jakie pominąć. Standaryzacja metody umożliwi porównanie wyników uzyskiwanych rożnymi technikami, a tworzone już bazy danych (European Bioinformatics Institute, International Life Sciences Institute) pozwolą na ich opracowanie i analizę. W najbliższej przyszłości można się spodziewać rozwoju techniki białkowych "chipów", które wraz z opisaną metodą "microarray" pozwolą na globalną ocenę molekularnych mechanizmów leżących u podłoża badanej patologii. Jedynie krok dzieli nas od wykorzystania nowych technik w praktyce klinicznej. Być może w niedalekiej przyszłości laserowe czytniki genomowych "chipów" zastąpią mikroskopy w pracowniach patomorfologicznych, a lekarz na podstawie wzoru ekspresji genów będzie podejmował decyzje jak leczyć swoich pacjentów.
Robert Palusiński
Dr n. med. Robert Palusiński jest pracownikiem Katedry Chorób Wewnętrznych Akademii Medycznej w Lublinie i Instytutu Medycyny Molekularnej Uniwersytetu Teksańskiego w Houston, USA
- S. Patel i wsp. (1998) Inhibition of alfa integrin and ICAM-1 markedly attenuate macrophage homing to atherosclerotic plaques in apoE-deficient mice. Circulation, 97, 75-81
- M. Schena i wsp. (1995) Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science, 270, 467-70
- K.J. Haley i wsp. (2000) Overexpression of eothaxin and the CCR3 receptor in human atherosclerosis: using genomic technology to identify a potential novel pathway of vascular inflammation. Circulation, 102, 2185-9
powrót do wydawnictwa 
|
