|
Niektóre zagadnienia diagnostyki i patogenezy zakażeń retrowirusami u bydła
Retrowirusy są grupą patogenów wywołujących przewlekłe zakażenia, którym towarzyszy często rozwój zmian o charakterze nowotworowym oraz stany immunosupresji. U bydła najczęściej notuje się zakażenia wirusem białaczki bydła (Bovine Leukemia Virus-BLV) oraz wirusem nabytego braku odporności (Bovine Immunodeficiency Virus-BIV). Wspólną cechą tych wirusów jest indukcja silnej odpowiedzi humoralnej, obecność prowirusowego DNA zintegrowanego z genomem zakażonej komórki oraz wywoływanie zakażeń o charakterze latentnym.
BLV jest czynnikiem etiologicznym enzootycznej białaczki bydła. Jest to choroba nowotworowa, którą cechuje rozwój zmian proliferacyjnych układu limfo-retikularnego prowadzący do przewlekłej limfocytozy - taką formę określa się stadium leukemicznym białaczki - i do zmian guzowatych w węzłach chłonnych i narządach wewnętrznych, co jest formą kliniczną białaczki. Walka z chorobą polega na możliwie wczesnym wykryciu zakażonych zwierząt i wyeliminowaniu ich z hodowli. Stąd tak duże znaczenie przywiązuje się do czułej i swoistej diagnostyki zakażeń wirusem BLV.
W celach diagnostycznych znalazły zastosowanie przede wszystkim metody serologiczne: prosta metoda immunodyfuzji w żelu i test immunoenzymatyczny ELISA. O skali badań serologicznych w Polsce świadczy fakt, że rocznie bada się około półtora miliona prób surowicy krwi. Problemy z tak szeroko stosowanymi badaniami serologicznymi związane są z rozbieżnymi wynikami otrzymywanymi przy stosowaniu różnych testów oraz (najczęściej) z reakcjami nieswoistymi, przyczyną których jest obecność białek pochodzących z surowicy krwi, dodawanych jako składnik podłoża hodowlanego. Rozwiązaniem takich problemów jest użycie rekombinowanych białek wirusowych, które wykorzystane są jako antygen diagnostyczny. W pracach własnych nad usprawnieniem diagnostyki zakażeń wirusem BLV otrzymano rekombinowane białko p24 kapsydu wirusa, syntetyzowane przez E.coli i zastosowano go jako antygen w metodzie western blot. Wybór tej metody podyktowany był możliwością weryfikacji reakcji nieswoistych, co nie jest możliwe w metodzie ELISA. W postępowaniu tym fragment genu gag kodujący białko p24 zamplifikowano metodą PCR, wklonowano do wektora pośredniego i przeklonowano do wektora ekspresyjnego będącego pochodną plazmidu pT7, zawierającego gen dla tioredoksyny. W komórkach E.coli ekspresja białka p24 występuje jako fuzja z tioredoksyną i znajduje się pod kontrolą promotora genu polimerazy RNA faga T7. Dodatkowo, obecność sekwencji dla 6 powtórzeń histydyny pomiędzy sekwencjami dla tioredoksyny i p24 ułatwia oczyszczenie białka fuzyjnego. Otrzymane w ten sposób rekombinowane białko o masie 42 kD wykorzystywane jest jako antygen w metodzie western blot, pozwalającej na jednoznaczne określenie występowania przeciwciał dla antygenu p24 wirusa BLV.
Cechą charakterystyczną retrowirusów, w tym BLV, jest latentny charakter zakażeń. Latencja wirusowa reprezentuje zespół mechanizmów dzięki którym wirus może egzystować przez długi okres czasu w zakażonej komórce. W takim ujęciu zakażenie latentne określane jest jako zakażenie, w przebiegu którego w komórce gospodarza stale obecne są kompletne kopie informacji genetycznej wirusa, które poddawane są procesom niekoniecznie prowadzącym do syntezy białek wirusa i w konsekwencji doprowadzających do braku odpowiedzi immunologicznej.
Jak się wydaje, za mechanizm latencji BLV odpowiedzialne są czynniki obecne w osoczu krwi zakażonych zwierząt, blokujące transkrypcję prowirusowego DNA. Niektóre dane mogą wskazywać, że są to związki podobne do interleukin lub są nimi produkty ekspresji genów kodujących zespół antygenów zgodności tkankowej (BoLA). Istnieją co najmniej dwie ważne konsekwencje zakażeń latentnych wirusem BLV: stan taki pozwala na wymknięcie się wirusa spod kontroli immunologicznej poprzez nieeksponowanie antygenów wirusowych na powierzchni komórki oraz sprzyja możliwości reaktywacji i ponownego pojawienia się infekcyjnych cząstek wirusa w komórkach latentnie zakażonych.
Biorąc pod uwagę takie konsekwencje, kluczowego znaczenia nabiera diagnostyka zakażeń latentnych BLV. Ogólnie wyróżnić można techniki oparte o krótkoterminowe hodowle limfocytów krwi, pozwalające na wykazanie obecności białek wirusowych w komórkach (test syncytialny) lub w lizatach komórkowych oraz metody pozwalające na wykrycie obecności prowirusowego DNA (hybrydyzacja z sondą molekularną i metoda PCR). Porównanie możliwości wykrycia zwierząt zakażonych przy użyciu tych metod oraz metod serologicznych wykazuje, że odsetek zwierząt, u których nie stwierdza się przeciwciał, a możliwe jest wykazanie ekspresji białek lub obecności prowirusa, waha się od 2 do 10 %. Nie zawsze jednak bezpośrednie wykazanie obecności białek wirusa jest możliwe, co tłumaczy się niewielkim odsetkiem (0,5-5%) zakażonych limfocytów krwi. Dlatego większe znaczenie diagnostyczne przypisuje się wykrywaniu prowirusowego DNA metodą PCR. W licznych pracach, także tych wykonanych w Państwowym Instytucie Weterynaryjnym wykazano, że metodą PCR można wykryć o 7-15% więcej zakażonych zwierząt niż byłoby to możliwe przy zastosowaniu metod serologicznych. Wyniki takie określać mogą zasięg występowania zakażeń latentnych w populacji bydła naturalnie zakażonego BLV. Nie zawsze jednak występowanie odczynów serologicznych koreluje z obecnością prowirusowego DNA. Niepowodzenie w wykrywaniu prowirusa u zwierząt serologicznie dodatnich można odnieść do niewystarczającej liczby kopii DNA-BLV dostępnych w metodzie PCR. Inną przyczyną może być brak prowirusa w limfocytach krwi obwodowej; jego obecność ograniczająca się do narządów limfatycznych. Jako kolejną przyczynę uwzględnia się występowanie defektywnych prowirusów stanowiących około 30% wszystkich form DNA-BLV izolowanych od zakażonych zwierząt, przy czym delecja, podobnie jak w przypadku wirusa HTLV-1 dotyczy najczęściej końca 5˘ genomu.
W przebiegu zakażenia latentnego przypuszczalną rolę w aktywowaniu ekspresji BLV in vivo przypisuje się zakażeniu innym retrowirusem, wirusem BIV, zaliczanym do lentiwirusów. Wpływ zakażenia tym wirusem na zdrowie zwierząt nie został do tej pory jednoznacznie określony. Po doświadczalnym zakażeniu cieląt notowano zmiany ilościowe subpopulacji limfocytów CD4 i CD8, umiarkowaną limfocytozę oraz opóźnioną odpowiedź immunologiczną na obcy antygen, a w badaniach in vitro zwiększoną proliferację limfocytów po stymulacji PHA oraz zaburzenia funkcji monocytów/makrofagów i neutrofili. Badania serologiczne przeprowadzone w Polsce potwierdziły występowanie przeciwciał dla BIV u około 4% bydła, przy czym znaczny odsetek zwierząt zakażony był również wirusem BLV. W pracach własnych wykazano, że współinfekcja wirusem BIV u owiec modulować może latencję i ekspresję wirusa BLV, czego dowodem było wyższe miano przeciwciał dla BLV i wyższa liczba syncytiów w hodowli komórek, gdy badano zwierzęta zakażone obydwoma wirusami. Jako jeden z czynników pobudzających mechanizm ekspresji BLV w warunkach współinfekcji wirusem BIV rozważać można udział interferonów. Lentiwirusy, jak wykazano to na przykładzie wirusa MMV i CAEV, indukują produkcję unikalnego interferonu, będącego nieglikozylowanym białkiem o ciężarze 54-64 kD, odgrywającego krytyczną rolę w utrzymaniu latencji lentiwirusów poprzez blokowanie proliferacji monocytów i hamowanie ich różnicowania w kierunku makrofagów. Niedawno wykazano obecność sekwencji długości 46 par zasad w regionie U5 LTR 5 wirusa BLV, zawierającej miejsce wiązania dla tzw. interferon regulatory factor IRF-1, dzięki któremu możliwe jest aktywowanie transkrypcji BLV typu cis W omawianych wynikach doświadczalnego zakażenia owiec potwierdzono dużo większe stężenie interferonu w surowicy krwi zwierząt zakażonych obydwoma wirusami niż u zwierząt zakażonych jedynie BLV.
W podsumowaniu podkreślić należy znaczny postęp jaki obserwuje się w zakresie diagnostyki i wyjaśnienia niektórych mechanizmów patogennego działania retrowirusów u bydła. Możliwe jest to przy zastosowaniu metod biologii molekularnej i inżynierii genetycznej.
Jacek Kuźmak
Prof. dr hab. Jacek Kuźmak pracuje w Państwowym Instytucie Weterynaryjnym w Puławach.
Tekst jest skrótem referatu wygłoszonego podczas pierwszej Konferencji Integracyjnej zorganizowanej przez lubelski oddział PAN 8 października 1999 roku.
powrót do wydawnictwa 
|
